ExpiCHO-S重组蛋白表达
名称 | ExpiCHO-S细胞F1电转瞬时表达实验方案 |
客户 | XX客户 |
ExpiCHO-S细胞F1电转瞬时表达载体实验方案
实验准备阶段
实验准备
双方按照表1进行实验所需仪器及耗材准备。
表1：实验所需试剂耗材
名称 | 数量 | |
客户 提供 | 细胞计数仪（Vi-Cell或其他计数仪器） | 1 |
蛋白质定量检测相关仪器 | 1 | |
离心机（可以离心15ml、50ml） | 1 | |
带摇床细胞培养箱37°C，8%CO2 | 1 | |
带摇床细胞培养箱32°C，8%CO2 | 1 | |
37°C，5%-8% CO2静置培养箱 | 1 | |
电转细胞总量( CD04培养基培养 ) | 1.2*10^9 | |
客户抗体质粒A：lc、hc 客户抗体质粒B：lc、hc | lc：200μg；hc：200μg lc：200μg；hc：200μg | |
500mL细胞摇瓶 | 2 | |
250mL细胞摇瓶 | 1 | |
50ml离心管 | 1包 | |
谷氨酰胺 | 按4mM添加至CD04培养基 | |
壹达 提供 | 电转仪F1 | 1 |
EBEL Buffer | 125ml | |
15ml规格电极（销售品） | 3+1 | |
15ml离心管（Nest） | 1包 | |
2×103A高浓缩补料 | 1瓶 | |
BR7补料 | 1瓶 | |
hIgG质粒 | 500μg | |
CD04培养基（电转前、电转后） | （500ml+500ml） | |
丁酸钠（100mM，1：100） | 3ml |
2、实验准备
2.1细胞准备：ExpiCHO-S细胞
由客户提供的ExpiCHO-S细胞，以2-3×105/ml的密度进行接种培养，约72h（3天）后收集细胞（此时细胞密度约为4-6×106），进行传代处理（传3代后）进行细胞电转染实验。
为保持电转稳定性，建议：
①传代后24-72h内进行电转染，建议初始冻存细胞株复苏后传代3代及以上再进行电转染；
②电转前细胞密度建议3-6*10^6/ml，最高不超过8*10^6/ml，细胞活率：95%以上；
③细胞代数不宜过短与过长，目前做过3-15代内，蛋白表达均比较稳定。
细胞培养条件：37°C，8%CO2，80%以上湿度，培养箱转速120rpm，振幅25mm
2.2 质粒准备
质粒包含客户提供的质粒A（lc、hc）；质粒B（lc、hc）。
质粒要求：大提后，以灭菌后的超纯水溶解（质粒浓度须大于1μg/μl），不含TE、EDTA等螯合剂；去内毒素: 10EU/ml以下；A260/A280:1.8-2.0；琼脂糖凝胶电泳检质粒条带清晰无杂带，以超螺旋带亮度是线性的1.5-2倍普通条带最佳。
实验方案及结果
H1质检细胞状态方案(略)
本方案不涉及H1质检，因而略过。
2.F1电转实验方案
EBXP-F1流式电转仪进行大体积电转体系为：1×108//100μg/ml，具体电转参数见表3；细胞电转后，需置于37°C细胞培养箱内静置孵育20min，取样进行台盼蓝染色计数，以4×106/ml的活细胞密度接种至细胞培养瓶，并1：100 添加丁酸钠（NaBu），37°C，8%CO2 培养箱内摇床培养；电转后24h，按要求添加补料，并将细胞样品转移到32°C，8%CO2 培养箱培养，d3、d5再次添加补料。具体电转后处理方式，详见表4。
表3 ExpiCHO-S细胞电转抗体表达载体参数
NO. | System | Density (cells/ ml) | Buffer | Plasmid | Plasmid Concentration (μg/ml) | Voltage (V) | Duration (μs) | Pulse No. | Interval (ms) | Flow rate (ml/min) | Buffer Volume (ml) | 电转后培养体积 |
1 | F1 | 1×108 | EBEL | 质粒A | 100
| 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 约60-80ml |
2 | F1 | 1×108 | EBEL | 质粒B | 100 | 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 约60-80ml |
3 | F1 | 1×108 | EBEL | 壹达hIgG | 100 | 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 约60-80ml |
备注：本轮实验培养电转后，客户电转后培养总体积大约XX ml×4×106/ml(具体按照细胞实际得率而定)。
按照表4进行添加补料，电转后37°C培养，24h后转移至32°C培养箱培养。
为了更好的监测细胞培养状态，以及抗体积累趋势，建议D3开始每天进行细胞密度和活率监测，并留样品进行蛋白检测。如有条件，可以同时监测细胞葡萄糖含量以及乳酸代谢。ExpiCHO-S细胞活率低于70%以下，建议离心获得蛋白样品。
表4 ExpiCHO-S细胞F1电转补料方案
NO. | Plasmid | Culture density（/ml） | Culture volume（/ml） | Culture medium | D0 | D1 | D3 | D5 | D7、D9 …… |
1 | 质粒A | 4×106 | 约60-80ml | CD04 | ①电转后1：100加入NaBu ②37°C培养 | ①壹达补料 ②32°C培养 | ①壹达补料 ②32°C培养 | ①壹达补料 ②32°C培养 | ①壹达补料 ②32°C培养 |
2 | 质粒B | 4×106 | 约60-80ml | CD04 | |||||
3 | hIgG质粒 | 4×106 | 约60-80ml | CD04 |
注：表4中培养体积仅为预判体积，实际培养体积由电转后活细胞实际得率而定。以上补料添加时间段参考壹达补料方案。
电转后24h，壹达实验组即d1天开始添加客户补料，电转后24h转移至32°C摇床培养；且在d3和d5天按照d1方式再加入补料培养；d1-d7培养过程中，均需取样进行台盼蓝染色计数，并收集1ml细胞悬液，12000rpm 5min离心获得蛋白样品。
三、实验步骤（参见壹达SOP《 RD-WI-02-045 悬浮型CHO-S细胞F1电转染标准操作流程A0》）
1、开机检测与设置电转参数：打开F1的电源键及开关键，仪器自检无误后，设置电转参数，电压200V，脉宽2000μs，电极次数4.5次，时间间隔611ms，流速4.71ml/min，设置摇摆，备用。
2、细胞观察：从培养箱中取出细胞摇瓶，立即取出100μl于96孔板中静置5min观察细胞形态，是否污染。（主要判断是否污染）
3、细胞计数：将细胞摇瓶用10ml移液器吹打混匀5次，取100μl细胞悬液加入100μl或者200μl 1× PBS稀释混匀，取10μl的细胞原液加入10μl 台盼蓝染色，即1：4或1：6稀释，混匀静置3min，取10μl使用血球计数板进行计数。若有仪器直接按照仪器计数方法进行。
4、收集细胞、离心弃去培养基：取所需数量细胞，移至离心管内300g，5min进行离心，弃上清。（如Eppendorf离心机50ml适配器，尽可能的去除培养基，由于培养基导电性过高，残留较多会影响电转Buffer的导电性，导致结果不稳定。）
5、DNA、细胞、buffer混合：使用移液器弃去上清，加入相应体积的EL buffer(如计划电转7ml，则加入7ml EBEL buffer )，再加入相应体积的质粒，使用移液器吹打10-12次使得质粒、buffer、细胞完全混匀；注意移液器吹打细胞过程中，切忌产生大量气泡，如果不小心产生大量气泡，请将不含气泡的液体转移至新的离心管中或者用移液器小心吸去气泡，连接F1电极耗材。（若质粒来源不清楚，建议加质粒加入到buffer液中，通过0.22μm滤膜过滤，然后再加入到细胞中，以保证无菌。）
6、安装电极：按照以下示意图将电转耗材由左到右安装至电转仪相应位置；
（安装耗材时按照下图方式进行连接。滤器位置不宜太靠仅黑色面板，以防电转过程中，摇摆导致刮花面板。）
注意液位感应处上下两个胶粒固定好位置；注意蠕动泵左右两个胶粒固定好位置
7、核对参数、电转：核对电转参数：电压200V，脉宽2000μs，电极次数4.5次，时间间隔611ms，流速4.71ml/min，开始电击。
8、处理耗材：电转后从右至左依次取下电转耗材，将耗材表面喷洒精处理后，移至生物安全柜，将收集管用自身的管盖拧紧。
9、孵育：将收集管置于37℃培养箱静置孵育20min。（若收样的离心管中还有空间，可添加适量CD04完全培养基后进行孵育，不要吹打混匀；如7ml收样体积+5mlCD04培养基孵育。此步骤要轻柔，电转后细胞比较脆弱。）
10、接种处理：孵育完成后，取出收集管，将细胞吹打均匀，台盼蓝染色计数（若电转密度为1×108/ml，建议至少稀释40倍），以活细胞密度为4×106/ml进行接种培养。
（一般电转后的细胞得率在60-80%之间，如5*10^8细胞总量，电转后实际细胞量可能在3.0-4.0*10^8，预判细胞培养体积为75-100ml；因此可以将上述收样管中细胞直接转移至70ml培养体积中，再进行细胞计数。最后根据4*10^6密度补足培养体积即可。）
11、细胞培养：细胞培养基中加入1mM NaBu，置于37℃ 8%CO2培养箱震荡培养，并在24h后将细胞转移到32℃培养箱培养。（除了添加Nabu，CD04培养基需要添加4mM谷氨酰胺。）
12、补料添加：在电转后的第1、3、5天按照5% 2×103A+1% BR7添加补料。（若细胞需要培养更长时间，可在第7、9天按照7.5% 2×103A+1% BR7进行添加，在第11天按照5% 2×103A+1% BR7添加补料）。
（电转后24h，即D1开始需要持续降温培养32°C，8%CO2，同时添加补料。建议D1开始监测葡萄糖含量以及乳酸代谢；D3开始监测细胞密度与活率；D5开始每天留样。）
四、实验结果
（用于结果跟进记录，不限定具体形式/格式）
报告撰写人 |
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审批 | 审核 |
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批准 | ||
备注：
ExpiCHO-S细胞复苏步骤：
1、从液氮中取出细胞，在37℃的水浴中旋转融化1-2min，迅速融化细胞，直到只剩下少量的冰。不要将细胞管浸入水中。
2、在细胞完全解冻之前，先用70%乙醇擦拭管子，然后在超净台中打开。
3、可以预准备9ml培养基，然后将融化后的细胞转移到其中，混匀后台盼蓝染色计数，以活细胞密度3e5/ml接种。
Note：1E7/支细胞株根据细胞得率一般可以培养25-30ml。
4、将细胞置于37℃，湿度 ≥ 80%，8% CO2的培养箱内培养。
Note：摇床转速设为125±5rpm，振幅设为19mm；转速120±5rpm时，振幅为25mm；转速为95±5rpm时，振幅为 50mm。
5、复苏后第三天，测定细胞密度以及存活率，细胞存活率应 ≥ 90%，后续培养细胞活率恢复至95%以上。
6、当细胞密度达到4×106-6×106/ml时，将细胞传代（一般在复苏后3-4天）
二、电转前客户细胞准备阶段：
2.1 ExpiCHO-S™表达培养基培养要求：
①ExpiCHO-S™ 细胞可实现高密度培养，细胞倍增时间：17-18h。
②该细胞具有广泛的细胞对数期（4×106-15×106/ml），对数期细胞活力应保持在95%以上，此外，该细胞的最高培养密度可达到20×106/ml。
上图摘自ExpiCHO-S细胞培养说明书
③建议活细胞初始接种密度保持在0.2×106-0.3×106/ml，可保持3天的培养时间，密度大概达到4×106-6×106/ml时，再将细胞传代。
活细胞初始接种密度保持在0.15×106-0.2×106/ml，可保持4天的培养时间，密度大概达到4×106-6×106/ml时，再将细胞传代。
建议细胞密度达到4×106-6×106/ml时，再将细胞传代。（电转前细胞密度建议同样保持4×106-6×106/ml，细胞活力95%以上）
④培养箱条件：将细胞置于37°C，湿度≥ 80%，8% CO2的培养箱内培养。
Note：摇床转速设为125±5rpm，振幅设为19mm；转速120±5rpm时，振幅为25mm；转速为95±5rpm时，振幅为50mm。
Note：如果细胞传代密度在早期对数生长周期之外，可能会导致细胞倍增周期延长以及更低的滴度。调整初始接种密度从而使细胞在传代时的密度为4×106-6×106/ml。
Note：对于常规的在125ml-2L 培养瓶内培养细胞，摇床转速设为125±5rpm，振幅为19mm；转速120±5rpm时，振幅为25mm；转速为95±5rpm时，振幅为50mm。
Note：对于3L的培养瓶，设置转速为90±5 rpm，振幅为19mm，转速为85±5rpm时，振幅为25mm，转速为80±5rpm时，振幅为50mm。
2.2 国产培养基培养要求：
①若客户仅用国产培养基，进行ExpiCHO-S细胞传代培养，建议初始接种密度0.3-0.5×106，可维持2-3天的培养时间，细胞密度建议不超过6×106/ml，再将细胞传代。（电转前细胞密度建议同样保持3-6×106/ml，细胞活力95%以上）
②细胞培养箱的培养参数，以及转速，振幅等同样参考上述ExpiCHO说明书中要求。
2、电转后实验准备阶段：
电转后无论ExpiCHO表达培养基或是国产培养基培养的ExpiCHO-S细胞，均要求4×106/ml密度进行培养，D0添加丁酸钠抑制剂；D1、D3、D5……间隔添加补料，且根据细胞状态一般建议D7-D10进行细胞收养检测蛋白量，期间不用再添加培养基。
