大肠杆菌表达系统

大肠杆菌蛋白表达原理

诱导原理：Lac 阻遏物是一种具有 4 个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态，Lac 阻遏物能与操纵基因 O 结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因 O 上解离下来，RNA 聚合酶不再受阻碍，发生转录。
 

大肠杆菌表达系统步骤

不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化，蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主      要包括蛋白表达鉴定：

1.表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择

• 拿到质粒，离心（3000r/min；2min）

• 在质粒中加入 TE（使质粒最终加入到 110μL 感受态细胞中的量为 80-100ng，据此确定加入 TE 的量

• 一般为（1μg 质粒加 20μLTE；2μg 质粒加 50μLTE；5μg 质粒加 100μL TE）

• 将质粒与 TE 混匀，加入 2μL 混液于感受态细胞中

• 将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min

• 取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激 90s，

• 再次放入冰箱（4℃）中，3min

• 拿出后取 200μL 的 LB 液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中

• 放入摇床（37℃； 195r） 中， 30nim 至 60min； （最佳 45min）

• 取出离心（3000r/min；2min）

• 去掉 200μL 的上清，留 100μL 左右上清悬浮沉淀，吸取 50μL 悬液涂平板，（先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热 20min）

• 把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h 至 16h）

2.表达鉴定第二天的任务，注意 Pcold 的表达温度

• 每个平板挑取单菌落至 4 支对应抗性的 LB（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”

• 将试管放入摇床（37℃；195r） 中，（单抗 3h 左右；双抗 4 左右；刚开始用可见分光光度计测 OD 值； 熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）），测 OD 值（0.6 至 0.8）

• 从“0”号管中取 700μL 悬液加入到 100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存

• 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入 2μL 的 IPTG（终浓度 0.5mM 最适）

• 视不同的载体选择适合的表达环境（PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达 6h；37℃表达 3h 至 4h（4 支试管，“0”“1”号试管 15℃表达过夜；“2”“3”试管 37℃表达 3h 至 4h）。Pcold：全部 15℃表达过夜）

3.表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度

• 从每组 4 支的试管中均取 500μL 菌液加入到 1.5ml 离心管中，（若 OD 值不一样，值小的可多取）离心

• （6000r/min），5min， 去上清，留沉淀（沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近）

• 在每个离心管中加入 500μL 的 DDH2O，悬浮沉淀，离心（6000r/min），5min， 去上清，留沉淀

• 在每支离心管中加入 45μL 的 1×PBS 和 45μL 的 2×Loading Buffer 悬浮沉淀（当溶质适量且均一的情况下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量）

• 放入煮样器（100℃） 25min

• 取出后离心（6000r/min） 3min， 电泳检测。

大肠杆菌表达系统

• 质粒载体：小型环状 DNA，能自我复制。一个完整的质粒载体必须要有复制起点、启动子、插入的目的基因、筛选标记以及终止子；此外对大肠杆菌表达载体的要求是：①操纵子以及相应的的调控序列，外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用；②SD 序列，即核糖体识别序列，一般 SD 序列与起始密码子之间间隔 7-13bp 翻译效率最高；③多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

• 目的基因：在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因韩有内含子不能，大肠杆菌不能对 mRNA 进行剪切，从而形成成熟的 mRNA，所以真核基因一般以 cDNA 的形式在大肠杆菌表达系统中表达。此外还需提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

• 表达宿主菌：表达蛋白的生物体即大肠杆菌。表达宿主菌的选择在大肠杆菌蛋白表达过程中是很重要的因素——多数人会直接选择实验室曾经用过的宿主菌，而不去追究原因。对于宿主菌的选择主要根据宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫键，可以选择 Origami 2 系列，Origami 能显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达；目的蛋白含有较多稀有密码子可用Rosetta 2 系列，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA 及 CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因的表达水平。

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• 大肠杆菌表达系统种类

• T7 大肠杆菌表达系统

以 T7 启动子、T7RNA 聚合酶等 T7 噬箘体转录体系的元件为核心构建的表达系统。T7 RNA 聚合酶一种高活性的RNA 聚合酶，mRNA 的合成速度比大肠杆菌内的 RNA 聚合酶快 5 倍，并某些不能被大肠杆菌 RNA 聚合酶转录的序列也可以转录，所以 T7 RNA 聚合酶和 T7 噬箘体启动子的存在的情况下，大肠杆菌本身的转录竞争不过 T7 噬箘体转录体系，最终受 T7 噬箘体启动子控制基因的转录。

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• Lac 和 Tac 大肠杆菌表达系统

它是以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的大肠杆菌表达系统，具有多顺反子结构，结构排列为：

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• 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA）
  原理：在无诱导物的情况下，负调节因子 lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。加入诱导剂后，IPTG 与 lacI 基因产物结合，使操纵基因解离出来，lac 操纵子的转录因此被激活。用 tac 启动子构建的表达系统称为 Tac 表达系统。
   

• PL 和 PR 大肠杆菌表达系统

以启动子 PL、PR 为核心构建的表达系统。PL 和 PR 表达系统具有很强的启动转录能力，诱导时不需要加入化学诱导剂，成本低廉，但在热刺激过程中，大肠杆菌中的一些蛋白水解酶会被激活，降解所表达的外源蛋白；其次是在      大规模发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式提高温度，需要较长的时间，这会降低诱导效果，从而对重组蛋白的表达量有影响。

此外还有其他表达系统，如 pH 调控型、营养调控型、糖原调控型等。

大肠杆菌表达系统比较

大肠杆菌与其他表达系统比较