离子交换色谱的原理介绍和实际操作

       离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指  被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种  带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变 pH 或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗  脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不  同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺  序也不同，从而被分离出来。
       离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架构成，骨架  上有许多共价结合的带电基团，如果侧链是带正电基团，就可与带
       负离子相结合，称为阴离子交换剂，吸附带负电蛋白质。如果侧链是带负电的基团，则称为阳离子交换剂。强离子      交换树脂在宽 pH 范围内保持离子化，而弱离子交换树脂只在窄 pH 值内离子化。

       绝大多数重组蛋白纯化都要用到离子交换。离子交换色谱的基础是高分辨率，可以直接放大规模应用在工业上，柱      再生容易，还可以使蛋白浓缩。大多数蛋白质的静电荷是负值，因此阴离子交换色谱的应用最为广泛。
实验设计

介质的选择
       离子交换介质首先要考虑目的分子的大小，因为目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团，因此也会影响介质      对目的分子的动力载量，从而影响其分离。
       对于大多数纯化步骤来说，建议从开始的阶段使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的 pH 范围。对于已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。而未知等电点的蛋白质，在实际操作中常采用这样的方法，先选      择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的 pH 缓冲液，将蛋白质样品透析至 pH7.0，然后过阴离子交换柱。根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液 pH。

流动相的选择
       离子交换色谱的流动相必需是有一定离子强度的并对 pH 有一定缓冲能力的溶液。为了避免目的蛋白失活，使用缓冲液可稳定流动相的 pH，使之在色谱过程中不发生明显变化，同时可稳定目的分子上的电荷量，保证色谱结果的重要性。
       选择缓冲液一般按照以下原则：阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，可用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸盐等； 阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等；起始缓冲液的浓度应尽可能低（<100mmol/L）这样可以使色谱柱上更多的吸附分离物质；缓冲液应不含会影响被分离物质活性和溶解度成分，洗脱时尽量不采用 pH 梯度洗脱。

色谱柱的选择
       离子交换色谱通常选用粗短柱，即高径比小的色谱柱。典型的离子交换柱高度在 5~20cm，高径比一般小于 5。如果需要增加离子交换剂的体积，只能从增加柱的直径而不能增加其高度。如果是连续梯度洗脱，可以适当增加柱的      长度。

案例介绍
离子交换是蛋白纯化中的重要手段，即可以用于捕获阶段，也可以用于精纯阶段。

预处理和装柱
1.将超纯水与沉降胶按 1:3 比例悬浮，轻轻搅匀；
2.将色谱柱固定到设备支架上，链接出口管道，从柱底端进口反向泵入超纯水，排除管道及筛板中的气泡，停泵，      然后从出口端放出部分超纯水，保留 1~2cm 高度超纯水，封死出口端，然后正向冲洗进口端管道和适配器， 排除筛板和管道中气泡；
3.通过玻璃棒引流将悬浮胶导入色谱柱，在柱上端补充部分超纯水，搅匀，装上适配器；
4.将柱出口端与色谱设备连接，以 0.2MPa 恒压装柱，装填至恒定的柱床高度，标记柱床胶面位置，关闭泵，松开适配器，降低适配器至胶面下 2mm 处，继续装填，待柱床高度稳定后，标记柱床胶面位置，降低适配器至柱上标记柱床位置下 2mm。固定适配器，继续装填 2~3 柱体积；
5.确定柱体积，测量柱高，计算柱体积及记录装柱时的最大流速；
6.选择最佳线速，用 0.5mol/L NaOH 冲洗柱，冲洗 3~5 体积；
7.接着用超纯水冲柱，冲洗 10 柱体积，至 pH 显示接近超纯水 pH。

柱的平衡
20mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH6.5，用 10 柱体积平衡缓冲液平衡柱子，直至 pH 及电导率监控显示与平衡缓冲液的 pH 及电导一致。
加样
根据柱体积及装柱的最大流速确定上样流速，上样流速不超过装柱最大流速的 75%，同时，上样流速也要尽可能低， 保证样品和介质充分发生作用。
洗脱
上样结束后，用平衡缓冲液冲洗 1~2 柱体积，使 UV280 响应信号重新回到基线。之后用含有 0.5mol/L NaCL 的溶液洗脱，冲洗 2~3 柱体积，收集色谱峰。

常见问题分析
一、纯化后样品纯度不高怎么办？
1. 若目标蛋白和杂蛋白等电点差异较大，目标蛋白通过穿透步骤获得，通过调节起始缓冲液 pH，使目标蛋白与填料之间的静电作用更强；
若目标蛋白和杂蛋白等电点差异较小，目标蛋白通过洗脱步骤获得，过调节起始缓冲液 pH，使目标蛋白与填料之间的静电作用更强；再调节洗脱溶液的离子强度和 pH，使目标蛋白与杂蛋白逐渐分离；

选择合适的离子交换填料及粒径； 柱没有经过起始缓冲液的充分平衡； 降低洗脱流速；
调整样品溶液黏度。
二、纯化后的蛋白收率较低怎么办？
调整样品 pH，使样品 pH 与起始缓冲液 pH 保持一致；
改变洗脱模式，如将线性梯度模式改变为阶段性梯度洗脱；  改变洗脱方法，如将 pH 洗脱方法改为盐梯度洗脱方法； 改变洗脱强度。
三、样品过于粘稠怎么处理？
样品过于粘稠可能是由于含有的蛋白太多，或者含有大分子量的核酸分子，通常有以下解决方法：     增加裂解前稀释细胞所用体积；
增加裂解时间，直至黏度下降，或者增加 DNase 和 Mg2+的剂量； 增加机械裂解细胞的效率；
降低上样流速。