酵母蛋白表达步骤/实验流程

       本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤，详细酵母表达流程。从感受态细胞制备，转化方法选择及操作，从化学试剂PEG1000 转化，电击转化，原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达，全套酵母蛋白表达标准操作流程。

质粒线性化
在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理，因此线性化是酵母转化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

毕赤酵母PEG1000 转化及感受态制备
配置缓冲液
1）缓冲液 A：1.0M 山梨醇，10mM 甘氨酸，pH8.35，3%（v/v）乙二醇，滤膜过滤，-20℃保存；
2）缓冲液 B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；
3）缓冲液 C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；
4）未污染的新鲜、试剂级 DMSO，-70℃保存
将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降；样品的转化，进行多组试验。

感受态制备
1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板（YPD：蛋白表达试剂配置），30℃培养 2 天；

2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3）过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值从 0.1 至 0.5~0.8；
4）3000~5000rpm 离心收集沉淀菌体，用 50ml 预冷 A 液洗涤，并重悬与 4mlA 液中；
5）根据每次使用量（0.1-0.2ml 左右）分装与 1.5ml 离心管中，每管加入 10ul 的预冷 DMSO，混合后迅速-80℃
/液氮（感受态可以放到-80℃ ，但是酵母表达建议感受态现做现用）

酵母转化
1）线性化质粒 50ug（可预冷）溶于 200ul 的 TE 中，直接加入冻存的酵母感受态中；
2）37℃水浴 5min，过程混合样品 2 次；
3）取出加入 1.5ml 缓冲液 B，彻底混匀；
4）30℃水浴 1 小时；
5）室温 2000rpm 离心 10min，去上清，得沉淀，重悬菌体与 1.5ml 缓冲液 C 中；
6）再次离心，去上清，得沉淀，轻轻加入 0.2ml 缓冲液 C 重悬；
7）将重悬的转化液涂与选择性培养基（根据抗性配置）中，30℃孵育 3-4 天，进行鉴定。
毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

感受态制备
1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板，30℃培养 2 天；
2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3）过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值 1.2~1.5；
4）4℃，5000rpm 离心 5min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；
5）4℃，5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；
6）再次 4℃，5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；
7）20ml，1mol/L 山梨醇洗涤 1 次；
8）将菌体溶于 200ul，1mol/L 预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化

酵母电转
1）准备好 80ul 的酵母感受态与线性化的质粒 1-5ug（冰上预冷 15min）混合，迅速放入 0.2cm 的电击杯中（电击杯冰上预冷灭菌），电击；
2）电击结束，迅速加入 1ml 山梨醇，涂平板（在摇床上培养 1h 后涂平板也可）；
3）MD 培养基生长 3-4 天，ROB 培养基上生长 4-5 天后，鉴定。
电击注意点
1）线性化质粒的含量在 1-5ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成；
2）感受态菌液收集，确定 OD 值在 1.2-1.5 之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单 OD 值不高，可能是OD 稀释倍数不够；
3）感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则：现做现用；且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；                                      4）电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在 75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响；
5）电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

原生质转化原理
酵母细胞具有细胞壁，细胞壁会组织其对外源 DNA 的摄入，因此，去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对 DNA 的吸收。利用藤黄节杆菌酶（为一种葡聚糖酶），可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁，否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到 SDS 的影响，可以加入 SDS 对其消化进行控制，以得到消化适度的细胞。消化获得 70%的原生质细胞时，效果最好。

试剂配制
转化当天，配制如下溶液：
① SE：1M 山梨醇，25mM EDTA，pH8.0
② SCE：SE：1M 山梨醇，1mM EDTA，10mM 柠檬酸钠缓冲液，pH8.5
③ SOS：1M 山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl2
④ CaS：1M 山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2
⑤ DTT，PEG：DTT 水配制为 1M 浓度，PEG 用水配制 40%（w/v）
⑥ CaT：20mM Tris pH7.5，20mM CaCl2
⑦ 藤黄节杆菌酶：用水配制成 3mg/ml 的浓度
⑧ 5%SDS 溶液，RD 融化琼脂 100ml，1M 山梨醇每次转化时配制
① SED：19ml LSE 加 1ml DTT
② PEG/Cat：1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他试剂
① YPD 培养基 1L，YPD 平板 1L
② RDB 平板 1L，RDHB 平板 1L

感受态制备及消化细胞壁                              
 1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板，30℃培养 2 天；
2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3）取培养的细胞 5ul，10ul，20ul 分别加入到含有 200mlLYPD 的液体培养基中，30℃震荡过夜（300rpm）；
4）第二天测每个培养瓶中的 OD600 值，并取出事先配置好的转化溶液，室温放置：
5）收集 OD600 值在 0.2-0.3 对应的培养瓶中的细胞，室温离心（1500rpm5min 左右），得到沉淀；如果没有培养瓶中的 OD 值在 0.3 左右的话，选择一个培养瓶，用新配置的培养基以 1：4 稀释，再次培养（2-3h 左右），直至出现OD 值为 0.2-0.3，收集细胞；
6）准备去除细胞壁，准备去壁试剂和待去壁的细胞；
7）准备去壁试剂：现配 SED，保证DTT（分析级）的新鲜度，配完放-20℃；
8）准备带去壁细胞：先用灭菌水清洗，转入离心管；1500rpm 离心 5min，收集细胞，用 20mlSED 重悬并洗涤离心；再次用 1M 山梨醇洗涤，离心（同上）；用SCE 重悬，分开至两个离心管中（每管 10ml 左右）；
9）准备藤黄节杆菌酶，取一管酶放置冰上，以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶，开始消化细胞（这一步可确定酶消化的最佳时间）；

最佳时间的确定

① 准备 20ml 5%SDS 溶液分光光度计调至 800nm，空白对照为 800ul 5% SDS 及 200ul SCE；
② 准备 10 个离心管，编号为 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50（根据时间编号）；
③ 取上述 8 步中的另一管细胞，取出 200ul 加入至 0 号管中，放置冰上，此为 0 点；
④ 加入 7.5ul 藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中，轻混，30℃孵育（不要晃动）用来建立最佳时间所用
⑤ 2min 时取 200ul 悬浮液至 2 号管中，同理 4，5，6，7，8min 时重复操作，读样品 OD800 值；
⑥  用公式计算细胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T  时间  OD800-0  时间  OD800  值）x100} 10）计算出去壁率为 70%左右时，得出最佳消化时间，同样操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化细胞
11）室温离心去除悬浮液，1M 山梨醇洗涤一次，0.6mlCaS 悬浮细胞，立即转化，去壁的细胞应立即转化。

转化毕赤酵母
1）取 100ul 将去壁细胞，放入 1.5ml 离心管中（灭菌）；
2）准备 10ug 线性化质粒（预冷）与去壁细胞混合，加入 1ml 新鲜 PEG/Cat 溶液，轻混，室温孵育 10min；
3）室温 750rpm 离心 10min，去除 PEG/Cat 溶液；并用 150ulSOS 培养基悬浮转化细胞，室温孵育 20min；
4）加入 800ul 1M 山梨醇，涂平板；
5）取 200ul 转化细胞和 RD（液体）混匀倒于 RDB 平板上，凝固后导致平板，30℃培养 4-6 天，出现转化子；
6）取 100ul 稀释细胞，与 RDH（液体）混匀，涂在 RDHB 上，凝固后倒置生长，30℃培养 4-6 天，出现克隆， 表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

Mut+和 Muts 表型的判断
待转化子在平板上生长一段时间后，进行 Mut+和 Muts 的筛选。挑取单克隆，在 MM 及 MD 培养基上划线或点（先在MM 平板上点，再在 MD 平板上点，一个克隆换一次牙签），30℃培养 2 天。观察，在MD 培养基上生长而在MM 培养基上不生长或长的很小即为 Muts 表型，其余为 Mut+表型。

Mut+的诱导表达
1）挑取单菌落，摇菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中，30℃，300rpm 培养至 OD600 为 2-6（培养
15-18h 左右观察）；
2）室温 2000rpm 离心 5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使 OD600 为 1.0 左右；将菌液至于 1L 摇瓶中，
30℃300rpm 培养，每 24 小时加入 100%甲醇，至终浓度为 0.5-1.0%；
3）根据时间点取样（1ml）至于 1.5ml 离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。

Muts 的诱导表达
1）挑取单菌落，摇菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中，30℃，300rpm 培养至 OD600 为 2-6（培养
15-18h 左右观察）；
2）室温 2000rpm 离心 5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使 OD600 为 1.0 左右；将菌液至于 1L 摇瓶中，
30℃300rpm 培养，每 24 小时加入 100%甲醇，至终浓度为 0.5-1.0%；
3）根据时间点取样（1ml）至于 1.5ml 离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。

酵母表达原理

      本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理，毕赤酵母表达能够高效表达的机制。
      巴斯德毕赤酵母（以下简称毕赤酵母）能够高效表达外源基因，是因为其有更强的强启动子，即醇氧化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢，在此反应中参与的酶是醇氧化酶（AOX1 和 AOX2）。其中，AOX2 的表达量比 AOX1 低得多，以甲醇为唯一碳源时，AOX1 增至细胞总蛋白的 40%。PAOX1 受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1 的表达受到甲醇的严格控制。
      巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上，这是通过把携带外源基因的表达质粒线性化，以同源重组的      方式整合到强启动子 PAOX1 的下游，目的基因一般插入到 5’AOX1 启动子和转录终止子之间的单克隆位点。

毕赤酵母蛋白表达系统

1. 酵母表达宿主菌Mut+和 Muts
在毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有两种基因编码，即 AOX1 和 AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力有 AOX1 提供，菌株利用甲醇的速度主要由 AOX1 基因表达的 AOX1 蛋白提供。当 AOX1 缺失，只存在 AOX2 时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为 Muts。存在 AOX1， 细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为 Mut+，这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种 Muts 和 Mut+产生的原理。
酵母表达系统常用宿主菌
GS115、KM71、SMD1168 是常用的表达宿主菌，均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型，如果表达载体上带有组氨酸基因，可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷，所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时，AOX1 基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的 AOX1 基因被强烈诱导，使目的基因大量表达。
有无甲醇诱导产生的 Mut+和 Muts 表现型
毕赤酵母的最适生长温度为 28-30℃，诱导期间超过 32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。Muts 和 Mut+ 菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1 启动子被强烈诱导，Mut+较 Muts 生长更快（4-5 倍）。

1. 酵母蛋白表达载体
酵母蛋白表达载体的选择
酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式，这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽，可根据基      因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。
① 胞内表达载体：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。该类载体将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。
② 分泌到胞外表达的载体：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，将外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由 89 个氨基酸组成α交配因子的引导。
③ 多拷贝插入表达载体：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

表达重组蛋白使其具体天然的 N 端
想实现表达重组蛋白使其具体天然的 N 端，将目的基因直接连接在 Kex2 蛋白酶切位点之后。Kex2 蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置为 Kex2 蛋白酶的酶切位点

毕赤酵母表达系统机制/原理
毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子（AOX1 和 AOX2）。AOX1 和 AOX2 及其产生的 Muts 和 Mut+表现型前文已经叙述过。AOX1 受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上，通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子 AOX 的下游，一般是插入到 5’AOX 启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。