稳转株构建基本原理与步骤【新手入门】

细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。且细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。

将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选，筛选来得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。

多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂，从感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液加入筛选药物。药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。

稳定表达细胞株主要应用于以下研究中：

1、需要长期在目的细胞中研究基因功能。通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也方便长期的实验研究；

2、部分蛋白半衰期及长，瞬时RNA只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，通过构建稳定株可以实验更好的基因干扰效果；

3、瞬转会引入不可预期的拷贝数表达（往往瞬时表达较高），导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选到拷贝数适量的细胞进行实验研究；

4、稳转株可以用于诱导表达系统的实验，用于控制基因的时空表达；

5、需要用目的细胞构建动物模型的实验，往往需要构建成稳定株。

慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

如何用慢病毒构建稳定表达细胞株：

1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选；

2、目的细胞的合适病毒滴度筛选；

3、慢病毒构建与包装与滴度测定；

4、慢病毒感染；

5、特定抗生素筛选稳转细胞株；

6、稳转细胞株鉴定。

稳转株的构建是一个长时间多平台合作的项目，有多种因素容易导致稳转株构建失败，你都遇到过哪些情况呢？