ABPP钓靶技术：原理、应用与前景
在现代生物化学与药物研发领域，ABPP（Activity - Based Protein Profiling）钓靶技术作为一种强大工具，正逐渐崭露头角。它能在复杂生物体系中对特定蛋白质活性进行精准检测与分析，为药物开发、疾病研究等提供关键信息。
一、 引言 传统中药历史悠久，使用大量天然植物、矿物和动物药物，疗效显著，然而其具体作用机制常不明确。筛选中药单体结合靶点，有助于从现代生物医学角度揭示中药在分子和细胞层面的疗效，提升药物精准治疗能力，避免无效或有害的治疗效果。
二、 ABPP钓靶技术原理 ABPP技术基于活性小分子探针与靶蛋白的特异性结合。探针含反应性基团，可与靶蛋白活性位点共价键结合，同时带有报告基团，用于后续检测与分析。通过一系列分离、纯化和检测手段，确定靶蛋白的身份与活性状态。
三、 ABPP钓靶技术优势 1.高特异性：能精准识别靶蛋白活性位点，避免非特异性结合。 2. 实时性：可在活细胞或生物体内实时监测靶蛋白活性变化。 3. 全面性：能对整个蛋白质组进行系统分析，发现新靶蛋白和潜在药物靶点。 4. 应用范围广：适用于多种生物体系和疾病模型。
四、 ABPP钓靶技术应用 1. 药物研发：在药物开发中，ABPP钓靶技术可帮助筛选和优化先导化合物，提高药物疗效与安全性。例如针对肿瘤细胞特定蛋白的活性检测，开发出肿瘤靶向药物。 2. 疾病诊断：利用该技术可对疾病相关蛋白进行快速检测与诊断。如在神经退行性疾病中，通过检测特定蛋白活性变化实现早期诊断与病情监测。 3. 生物医学研究：为研究生物体内蛋白质功能与作用机制提供重要手段。通过对不同生物体系中蛋白质活性的分析，深入了解生命过程本质。
五、 筛选中药单体结合靶点的方法 1. SPR配体垂钓：SPR技术（Surface Plasmon Resonance）基于表面等离子体共振现象，能实时、无标记地检测分子间相互作用，如抗原 - 抗体、药物 - 靶标蛋白、DNA - RNA等。基于此的配体垂钓技术，通过将药物分子偶联在芯片上，从总蛋白中钓取与药物结合的蛋白。实验步骤如下： - 生物素化小分子固定：将生物素化的中药单体通过链霉亲和素偶联到芯片上。 - 垂钓回收：将提取的细胞总蛋白混合物进行垂钓回收。 - 质谱检测：利用质谱技术比较实验组和对照组的成分差异，鉴定出潜在能与中药单体结合的候选蛋白。 - 案例：暨南大学医学院费嘉教授团队通过SPR - MS技术鉴定小檗碱作用靶点UHRF1。该研究将小檗碱固定到传感芯片上，加入细胞裂解液孵育，垂钓靶蛋白并回收，经质谱鉴定，确定UHRF1为小檗碱的潜在作用靶点，并通过SPR和分子对接验证了相互作用。 2. CETSA - MS（TPP，热蛋白质组学）：CETSA技术基于蛋白质热稳定性变化，当药物分子与靶标蛋白结合时，会影响蛋白质结构稳定性。CETSA - MS在此基础上结合蛋白质组学，对经药物及热处理后的差异蛋白进行质谱鉴定。实验步骤如下： - 细胞给药处理：细胞给药后进行裂解。 - 加热处理：离心后取上清裂解液进行梯度或恒温加热（单一给药使用梯度加热、梯度给药进行恒温加热）。 - 离心去除沉淀：离心去除加热变性沉淀的蛋白。 - 电泳与质谱鉴定：将上清进行SDS - PAGE电泳，对差异条带进行质谱鉴定。 - 案例：郑州大学第一附属医院夏总平教授团队采用CETSA - MS技术鉴定槲皮素抗衰老靶点。该研究分别用DMSO和槲皮素处理HEK293T细胞，每组细胞悬液均分为12份，在特定温度下进行热处理，然后细胞裂解，获得上清液中的可溶性蛋白进行质谱分析。鉴定出CBR1、GSK3A和MAPK1为槲皮素的作用靶点，并通过CETSA和pull - down验证了相互作用。 3. ABPP（化学蛋白质组学）：基于活性的蛋白质谱（ABPP）结合活性探针和蛋白质组学技术，鉴定活性小分子的蛋白质靶标。实验步骤如下： - 探针制备：设计合成活性分子探针，并进行活性鉴定。 - 孵育与结合：将探针与总蛋白孵育（或与细胞孵育后提取总蛋白）。 - UV照射与点击反应：孵育完成后，先后进行UV照射（使活性分子与靶蛋白共价相连）、点击化学反应（给活性分子引入报告基团，如生物素）。 - 靶蛋白富集鉴定：通过报告基团对靶蛋白进行富集鉴定（如通过链霉亲和素磁珠分离生物素标记的蛋白）。 - 蛋白质组学分析：对收集到的蛋白进行蛋白质组学分析。 - 案例：厦门大学林圣彩院士团队和邓贤明团队基于化学探针法找到二甲双胍的分子靶点——PEN2。该研究通过合成二甲双胍的化学探针，对细胞总蛋白进行垂钓，经质谱等分析鉴定，结合DSC、SPR、ITC等技术确定二甲双胍通过与PEN2蛋白的互作介导AMPK的激活。 4. DARTS - MS：DARTS（drug affinity responsive target stability - MS）利用小分子配体与靶蛋白结合后复合物稳定性提高的特点，用蛋白酶处理样品，通过SDS - PAGE比较实验组和对照组差异，再通过蛋白质组学鉴定差异条带。实验步骤如下： - 细胞裂解：提取总蛋白（使用温和裂解液，保持蛋白活性）。 - 孵育与对照：向总蛋白中添加药物小分子孵育，同时对照加入等体积的实验组中溶解小分子的溶剂。 - 蛋白酶处理：向上述实验组和对照组中分别加入等量蛋白酶孵育。 - 筛选鉴定：进行SDS - PAGE或LC - MS筛选鉴定靶蛋白。 - 案例：重庆医科大学基础医学院骨科超声医学与工程国家重点实验室郭风劲教授、聂茂副教授及杜宇副主任医师团队通过DARTS - MS鉴定人参三醇靶点。该研究将人参三醇和总蛋白孵育后加入嗜热菌蛋白酶孵育，再加入PMSF终止蛋白酶水解，最后进行SDS - PAGE，对差异条带进行质谱鉴定，确定UFL1为人参三醇的潜在靶标，并通过DARTS - WB、CETSA和分子对接验证了相互作用。
六、 结论 ABPP钓靶技术在药物研发、疾病诊断和生物医学研究等领域具有重要意义。通过对不同技术的应用，能够更深入地了解中药单体的作用机制，为药物开发提供有力支持。未来，随着技术的不断发展和完善，ABPP钓靶技术将在更多领域发挥重要作用，推动生物医学研究的进步。
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